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Study: Regeneration difficulties in patients with FQAD can limit the use of iPSc-based cell therapy


Levoflox26
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Re: Study: Regeneration difficulties in patients with FQAD can limit the use of iPSc-based cell therapy

#31133

Beitragvon Levoflox26 » 22.05.2022, 17:33

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Studie: Regenerationsschwierigkeiten bei Patienten mit FQAD können den Einsatz einer iPSc-basierten Zelltherapie einschränken



Abstract
Die Ätiopathogenese des Fluorchinolon-assoziierten Behinderungssyndroms (FQAD) ist noch nicht vollständig geklärt, doch könnte die Forschung durch die Verwendung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSc) von Menschen mit diesem Syndrom Fortschritte machen. Ebenso könnten iPSc bzw. ihre Derivate in der Therapie eingesetzt werden, nicht nur für FQAD, sondern auch für andere Erkrankungen, bei denen autologe iPSc und ihre Derivate hilfreich sein könnten. Von zehn Spendern mit FQAD wurde Urin gesammelt, und die Reprogrammierung dieser Zellen wurde mit Hilfe des Epi5TM Episomal iPSC Reprogramming Kit durchgeführt. IPSc wurden in einer von zehn Urinzellen der Person erzeugt. Obwohl Urinzellen als die einfachsten reifen Zellen gelten, die in iPSc umprogrammiert werden können, wurden die Urinzellen von sechs aufeinanderfolgenden Spendern schnell seneszent. Von den drei verbleibenden Spendern konnten keine stabilen primären Urinzellkulturen gewonnen werden. Wiederholte Versuche, Epithelzellen zu reprogrammieren, waren nicht erfolgreich. Bei parallel durchgeführten Studien mit gesunden Spendern war die Reprogrammierung in sechs von zehn Fällen erfolgreich. Diese Daten deuten auf ernsthafte Einschränkungen im Regenerationssystem von Personen mit FQAD hin. Folglich deutet dies darauf hin, dass die Therapie mit autologen iPSc-Derivaten in ihrem Fall auf ernsthafte Schwierigkeiten stoßen könnte, dennoch wurde die erste iPSc-Zelllinie von einer Person mit FQAD etabliert.
Einführung

Chinolon-Antibiotika töten Bakterien ab, indem sie Enzyme hemmen, die als Topoisomerasen der Klasse II bezeichnet werden. Diese Enzyme sind an der Entflechtung der DNA während der Zellproliferation beteiligt. Chinolone binden an diese Enzyme und verhindern so die normalen Enzymreaktionen [1].

In den 1980er Jahren modifizierten Forscher Chinolone, indem sie Fluoratome in die Struktur der Verbindung einfügten, wodurch die Penetration dieser Antibiotika in Gewebe erhöht wurde. Zu den durchdrungenen Geweben gehören das zentrale Nervensystem und das Herzgewebe, was die Wirksamkeit gegen bakterielle Infektionen verbessert. Diese Maßnahmen führten jedoch auch zum Tod und zur Schädigung von Organen wie der Leber. Daher wurden einige von der FDA zugelassene Fluorchinolone (FQ) aus dem Verkehr gezogen [2]. Nach wie vor leiden viele Patienten nach der Einnahme zugelassener Antibiotika unter rätselhaften und recht schwerwiegenden Nebenwirkungen, die von der FDA schließlich als Fluorchinolon-assoziierte Behinderung (FQAD) eingestuft wurden [3]. Im Falle von FQs wird vermutet, dass die Symptome durch mitochondriale [4, 5] und genomische DNA-Schäden [6, 7, 8] verursacht werden. Zu diesem Zweck haben wir versucht, ein Modell mit induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSc) zu entwickeln, um diese Krankheit zu untersuchen und zu prüfen, ob die Reprogrammierungstechnologie in Zukunft zur Behandlung von Patienten mit FQAD und ihren anderen Erkrankungen eingesetzt werden kann, bei denen autologe induzierte pluripotente Stammzellen und deren Derivate verwendet werden können. Urinale Zellen gelten als relativ leicht umzuprogrammieren [9]; leider konnten iPS-Zellen nicht einfach aus den Körperzellen dieser Patienten erzeugt werden. Dies wirft zusätzliche Bedenken hinsichtlich des weltweiten Einsatzes von FQ und der Zugänglichkeit von iPSc-abgeleiteten Behandlungen für FQAD-Patienten auf.

Materialien und Methoden
Zellkultur

Epithelzellen wurden aus Urinproben nach dem zuvor beschriebenen Protokoll isoliert [10]. Kurz gesagt: 100 ml Urinprobe wurden gesammelt, in ein konisches 50-mL-Röhrchen überführt und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 400×g zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt; das Zellpellet wurde zweimal mit 25 mL PBS gewaschen, das mit Penicillin (100 U/mL), Streptomycin (100 µg/mL) und Amphotericin B (0,25 µg/mL) versetzt war, und erneut zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das Zellpellet wurde in Nierenepithelzell-Wachstumsmedium (REGM BulletKit, Lonza) suspendiert und auf mit Gelatine beschichtete Zellkulturplatten (Attachment Factor Protein, Life Technologies) plattiert. Nach Erreichen einer Konfluenz von 90 % wurden die Zellen mit TrypLE Select (Life Technologies) zur weiteren Expansion in eine neue Vertiefung passagiert.

Induzierte pluripotente Stammzellen wurden gemäß Drozd et al. kultiviert [9].
Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies

Zur Bestimmung der ROS-Werte wurde ein Assay-Kit für zelluläre reaktive Sauerstoffspezies (ROS) (Abcam, ab186027) gemäß dem Herstellerprotokoll verwendet. Die statistische Analyse wurde mit der Software GraphPrism 5 durchgeführt. Die Vergleiche zwischen den Gruppen wurden mit Hilfe der Einweg-ANOVA mit Dunnett's multiplem Vergleichstest durchgeführt. Die Fehlerbalken geben die SD an (n = 3). P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
Reprogrammierung von Epithelzellen der Harnwege in iPSc und anschließende Differenzierung

IPS-Zellen wurden wie zuvor beschrieben erzeugt [9]. Die Epithelzellen der Harnwege wurden in einer Dichte von 8 × 104 pro Vertiefung einer mit Geltrex-Basismatrix beschichteten Sechs-Well-Platte ausgesät. Die Zellen wurden in REGM-Medium gehalten. Nach der Inkubation über Nacht wurde das Kulturmedium durch frisches ersetzt, und die Zellen wurden mit 2 μg episomaler Plasmide (Epi5™ Episomal iPSC Reprogramming Kit, Life Technologies) transfiziert, jeweils 400 ng von: pCE-hOct3/4, pCE-hSK pCE-hUL, pCE-mp53DD, pCXB-EBNA1 und 1 μg eines zusätzlichen Plasmids zur Erhöhung der Effizienz - pCE-mCherry-miR302/367. FuGENE HD-Transfektionsreagenz (Promega) wurde in einem Verhältnis von 3:1 zwischen Reagenz und DNA in vorgewärmtem Opti-MEM-Medium verdünnt und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Plasmid-DNA wurde der Mischung bis zu einem Gesamtvolumen von 100 μl zugegeben und 30 Minuten lang inkubiert. Die Lösung der Komplexe wurde tropfenweise direkt zu den Zellen gegeben, die in einer Vertiefung einer Sechs-Well-Platte in 2 ml Medium gewachsen waren.

Am nächsten Tag wurde das Kulturmedium durch TeSR-E7-Medium (StemCell Technologies) ersetzt, und die Transfektion wurde wie zuvor wiederholt. Das TeSR-E7-Medium wurde bis zu zwei Wochen nach der Transfektion jeden Tag gewechselt. Am 15. Tag wurde das Nährmedium zu Essential 8 gewechselt. In den folgenden zwei Wochen wurde das Medium täglich gewechselt. Innerhalb von zwanzig bis dreißig Tagen nach der Transfektion wuchsen die iPSCs auf eine für den Transfer geeignete Größe. Die Kolonien wurden auf neue Geltrex-beschichtete Kulturschalen übertragen und in Essential-8-Medium weiter vermehrt.

Schließlich wurde die Differenzierung der iPS-Zellen in drei Keimschichten wie zuvor beschrieben durchgeführt [9].

Immunofluorescence analysis

For the immunocytochemical analyses, iPSc or other cells were seeded on Geltrex-coated glass coverslips. Cells were fixed in 4% paraformaldehyde in PBS for 20 min (iPSc) or 15 min (differentiated cells) and permeabilized with 0.25% (iPSc) or 0.1% (differentiated cells) Triton X-100 in PBS for 10 min at room temperature. Next, preparation was performed as already described [9] (Table 1).

Ergebnisse
Isolierung und Vermehrung von Epithelzellen aus dem Urin

Es wurden Urinproben von zehn Spendern mit FQAD gesammelt (Abb. 1a, Tabelle 2). Alle getesteten Personen waren vor der FQ-Verordnungstherapie bei guter Gesundheit. Bei drei Spendern (DONOR 1-3) konnten keine stabilen Urinprimärzellkulturen gewonnen werden. Die Isolate von weiteren vier von zehn Spendern (DONOR 4-7) enthielten einzelne lebensfähige Epithelzellen, die sehr schnell alterten. Zwei der stabilen Primärzellkulturen (DONOR 8 und DONOR 10) wurden direkt nach der Transfektion mit reprogrammierenden Episomen seneszent (Abb. 1b). Schließlich waren Epithelzellkulturen der Harnwege von drei der zehn Personen mit FQAD geeignet, um dem Prozess der Reprogrammierung unterzogen zu werden. Nur ein Spender lieferte Zellen, die erfolgreich umprogrammiert werden konnten. In parallelen Studien mit gesunden Spendern wurde in sechs von zehn Fällen ein Erfolg erzielt [9].

Analyse des oxidativen Stressniveaus

Aufgrund der weit verbreiteten Seneszenz von Zellen während der Kultivierung oder Reprogrammierung wurde eine Analyse des oxidativen Stressniveaus durchgeführt. Der Vergleich ausgewählter Proben von Personen mit FQAD (Spender 9, Spender 10 und zusätzliche Proben von Spender 11 und Spender 12, bei denen der Reprogrammierungsversuch noch nicht durchgeführt wurde) mit der Kontrollgruppe (gesunder Spender) zeigte keine statistisch signifikanten Unterschiede im Niveau des oxidativen Stresses (Abb. 1c).
Reprogrammierung von Epithelzellen aus dem Urin

Die Reprogrammierung der Zellen erfolgte durch die forcierte Expression der Transkriptionsfaktoren NANOG, OCT3/4, KLF4, SOX2, L-MYC und LIN28, die mit einem nicht-viralen episomalen System auf der Basis von EBNA-1/oriP-Elementen eingeführt wurden. Um die Effizienz des Reprogrammierungsprozesses zu erhöhen, wurden auch Vektoren eingesetzt, die für die microRNA 302/367 und das mutierte p53-Protein kodieren. Alle drei erfolgreich stabilisierten Urin-Zelllinien wurden einer Transfektion unterzogen (DONOR 8-10). IPSc wurden nur von einem Spender (DONOR 9) erzeugt, und in den beiden anderen Fällen (DONOR 8 und DONOR 10) wurden die Zellen schnell seneszent (Abb. 1b). In den beiden letztgenannten Fällen waren wiederholte Versuche der Reprogrammierung nicht erfolgreich. IPSc-Kolonien begannen sich am Tag 16 nach der ersten Transfektion zu bilden und wurden am Tag 21 mechanisch von der Platte entfernt. Die Kolonien wurden bis zur Passage 10 weitervermehrt. Die stabilen iPS-Zellen wurden auf das Vorhandensein von Pluripotenz-assoziierten Markern untersucht. Um die Identität der iPSc zu überprüfen, wurde ein Immunfluoreszenztest mit Anti-OCT3/4-, Anti-SOX2-, Anti-TRA-1-60- und Anti-TRA-1-81-spezifischen Antikörpern durchgeführt (Abb. 2a). Die gewonnenen iPSc wiesen einen normalen menschlichen Karyotyp auf (Abb. 2b) (Karyotyp-Analyse durchgeführt von der Firma GENOS, Polen).

Differenzierung der erzeugten iPSc in Keimschichten

Eine stabile Kultur der gewonnenen iPSc wurde routinemäßig in Keimschichten differenziert. Die Immunfluoreszenzanalyse zeigte die Expression von Markern, die für das Endoderm - SOX17, Mesoderm -αSMA und Ektoderm - MAP2 charakteristisch sind (Abb. 2c).
Diskussion

Die Wirkung von Fluorchinolonen auf Zellen und Gewebe ist nur unzureichend bekannt. IPS-Zellen sind zu einem wertvollen Forschungsmodell für viele Krankheiten geworden. Im Falle von FQs wird vermutet, dass die Symptome durch mitochondriale und genomische DNA-Schäden verursacht werden [4,5,6,7,8]. Der Einfluss dieser Veränderungen auf die Zellen kann mit Hilfe eines iPS-Zellmodells getestet werden. IPS-Zellen könnten auch ein potenzielles therapeutisches Instrument für Patienten mit FQAD werden. Ausgehend von iPSc könnte eine regenerative Therapie durchgeführt werden, beginnend mit den typischen Sehnenschäden, die bei FQAD auftreten. Im Falle von Mitochondrienschäden ist es eine Überlegung wert, iPS-Zellen mit dem höchsten Anteil an normalen Mitochondrien für therapeutische Zwecke auszuwählen. Ein solcher Ansatz könnte möglicherweise die Auswahl geeigneter Zellen für die Entwicklung fortschrittlicher therapeutischer Arzneimittel ermöglichen.

Es ist bekannt, dass Urinzellen sehr leicht zugänglich und einfach zu reprogrammieren sind. Drozd et al. [9] zeigten, dass diese Zellen im Vergleich zu Hautzellen eine höhere Anzahl von iPSc-Kolonien erzeugen (Urinzellen sind 100 Mal effizienter). Narbenzellen waren am schwierigsten umzuprogrammieren (etwa 500-mal weniger effizient als Urinzellen), was für die Verwendung in dieser Studie ein Problem gewesen sein könnte, da FQAD-Patienten häufig strukturelle Hautschäden aufweisen. Nach Drozd et al. ist der epitheliale Phänotyp von Urinzellen höchstwahrscheinlich pro-reprogrammiert. Es ist bekannt, dass fibroblastische, aber nicht epitheliale Zellen während der Reprogrammierung MET durchlaufen müssen. Schließlich weist die Subpopulation der Urinzellen eine Expression von TRA-1-60 und TRA-1-81 auf [9]. Die Effizienz der Reprogrammierung von Blutzellen ist ähnlich wie die Effizienz der Reprogrammierung von Fibroblasten [11]. All dies deutet darauf hin, dass andere Zellen bei FQAD schwieriger umzuprogrammieren sind als Urinzellen; wir können jedoch eine einzigartige Schädigung der Niere bei diesem Syndrom nicht ausschließen. Die ROS-Analyse zeigte keine Unterschiede zwischen Zellen von gesunden Spendern und Zellen von FQAD-Patienten, was darauf hindeutet, dass oxidativer Stress in diesem Fall nicht direkt mit der Zellalterung und dem Scheitern der Reprogrammierung verbunden ist.

Diese Studie hat gezeigt, dass es sehr schwierig ist, iPS-Zellen aus Urinepithelzellen von Patienten mit FQAD zu erzeugen. Ebenso wichtig ist die Tatsache, dass die Effizienz der Zellkultur sehr gering war, da nur einer von zehn Patienten Zellen lieferte, die für die Reprogrammierung geeignet waren. Dies ist überraschend, da andere frühere Studien zeigten, dass Urinzellen eine sehr effiziente Quelle für die Reprogrammierung sein sollten [9, 12]. Eine wichtige Tatsache bei FQAD-Patienten ist, dass ihr Bindegewebe geschädigt ist; diese Studie deutet jedoch auch darauf hin, dass die Nierenstrukturen durch FQs bevorzugt geschädigt werden können. Es muss betont werden, dass bisher niemand in der Lage war, zu definieren, welche Art von Zellen aus dem Urin genau reprogrammiert werden; in unserer früheren Forschung haben wir jedoch Zellen entdeckt, die Marker für Stammzellen aufweisen [9]. Eine Überprüfung des Vorhandenseins und des Prozentsatzes dieser Zellen im Urin von FQAD-Personen sollte in Betracht gezogen werden. Wenn diese Annahme zutrifft, würde dies als Marker für eine Fehlfunktion der regenerativen Systeme dienen.

Es scheint, dass es kein einfaches Modell für die Reprogrammierung von Zellen bei der Untersuchung dieses Syndroms gibt, was die Forschungsmöglichkeiten einschränken könnte. Künftige Bemühungen um die Anwendung der regenerativen Medizin bei FQAD-Personen auf der Grundlage der Reprogrammierungstechnologie werden ein anspruchsvoller Prozess sein, der noch verfeinert werden muss. Die Tatsache, dass es in dieser Studie gelungen ist, das erste Modell einer iPS-Zelllinie von einer Person mit FQAD zu etablieren, kann Hoffnung für die Entwicklung zukünftiger Behandlungen geben.

Wenn du heute schon aufgibst, wirst du nie wissen ob du es morgen geschafft hättest.

gefloxt 10/2016 = 10 x 500mg Levo und 9/2017 = 5 x 250mg Levo
davor einige Male ohne Symptome Levo und mind. 1x Cipro

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Re: Study: Regeneration difficulties in patients with FQAD can limit the use of iPSc-based cell therapy

#31150

Beitragvon Hopesoon » 23.05.2022, 20:14

Vielen Dank für die Übersetzung!
Juni 2010 Levofloxacin 500 mg 7 Tabletten
Juli 2020 Ciprofloxacin 500 mg 1-0-1 für 5 Tage

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Re: Study: Regeneration difficulties in patients with FQAD can limit the use of iPSc-based cell therapy

#31151

Beitragvon Hopesoon » 23.05.2022, 20:18

Und natürlich auch danke für das Einstellen dieser Studie!
Juni 2010 Levofloxacin 500 mg 7 Tabletten
Juli 2020 Ciprofloxacin 500 mg 1-0-1 für 5 Tage

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Re: Study: Regeneration difficulties in patients with FQAD can limit the use of iPSc-based cell therapy

#31245

Beitragvon EagleEyeC » 06.06.2022, 14:39

Limitation: Menge der Teilnehmer. Das ist praktisch nicht aussagekräftig (Ich sage das nur, nicht das jetzt jeder Panik hat und denkt, es ist unmöglich von FQAD auszuheilen)


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